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Accueil du site > Thèmes de recherche > Signalisation et transport membranaire > Les maladies infectieuses

Les transporteurs bactériens et la résistance

La résistance bactérienne est un problème majeur de santé publique, avec l’apparition de phénomènes de multi-résistance touchant de plus en plus de souches bactériennes, avec la réémergence de maladies infectieuses telles que la tuberculose, la légionellose, l’hépatite, le sida et bien d’autres, et avec le manque de nouvelles molécules thérapeutiques sur le marcher depuis plus de 20 ans. Le but de notre projet est de trouver de nouvelles cibles pour luter contre la résistance aux antibiotiques, qui ne soient pas redondantes avec l’arsenal thérapeutique actuel, afin de ralentir la capacité de la bactérie à trouver une riposte. Une des défenses des bactéries est l’expulsion de l’antibiotique via des pompes à efflux (Lomovskaya, 2007). A cause de ces machineries, la plupart des antibiotiques classiques n’arrivent même pas jusqu’au compartiment cellulaire qu’ils sont supposés atteindre. En conséquence, ces pompes à efflux constituent des cibles thérapeutiques intéressantes, vu que leur blocage pourrait restaurer l’utilité de l’arsenal d’antibiotiques actuel. Notre équipe se focalise sur l’étude de quatre pompes à efflux de la bactérie gram négatif Pseudomonas aeruginosa, un pathogène opportuniste et un des principaux facteurs d’infections nosocomiales associées à une morbidité et une mortalité élevées (Nakae, 1997). Ces pompes sont constituées de l’assemblage de trois différentes protéines (Nikaido, 2009) :

- Une protéine membranaire cytoplasmique (Resistance Nodulation Division : RND) qui représente la pompe proprement dite agissant grâce à la force proton motrice (H+) avec une spécificité de substrat assez large,
- une seconde protéine localisée dans la membrane externe (Outer Membre Factor : OMF),
- et une troisième protéine (Membrane Fusion Protein : MFP), encrée dans la membrane interne et localisée dans l’espace périplasmique, qui fait le lien avec les deux autres. Les quatre pompes présentent différents phénotypes de résistance. Seul le système MexAB-OprM est exprimé de façon constitutive, les autres pompes n’étant exprimées que dans des circonstances particulières de pression de résistance.

Comme alternative à l’approche classique ciblant la seule fonction de la pompe RND, nous nous proposons d’empêcher l’assemblage des trois protéines, ce qui représente une approche originale n’ayant jamais été étudiée jusqu’à présent, et ce principalement à cause du manque d’information que l’on a sur le mécanisme de l’assemblage au niveau moléculaire. Aussi nous voulons caractériser les conditions et les mécanismes menant à la formation de ces pompes à efflux et décrire les différentes surfaces d’interaction. Nous avons dores et déjà résolu la structure d’OprM (la protéine OMF) à 2,4Å de résolution. Cette structure était fermée à ses deux extrémités, ne permettant pas le transport d’antibiotiques. En conséquence, en collaboration avec le Pr. C. Etchebest, nous avons étudié son ouverture en soumettant notre structure à une analyse par modes normaux, ce qui a permis de mettre en évidence comment la protéine pouvait s’ouvrir grâce à la combinaison de deux mouvements, un mouvement de type "ouverture de diaphragme" et un mouvement d’extension de la protéine entière (Phan, 2010). Cette analyse a mis en évidence le rôle possible de certains résidus comme "verrou d’ouverture", hypothèse que nous allons vérifier par une étude de mutagenèse. Nous allons poursuivre l’étude structurale des différents partenaires de l’assemblage. Pour ce faire, nous développons différents outils de cristallisation, tels que l’utilisation d’une phase éponge pour stabiliser les protéines membranaires dans un environnement régulier (collaboration avec W. Urbach, ENS, Paris), l’utilisation de nouveaux détergents présentant différentes propriétés électrostatiques (collaboration avec P. Falson, Lyon), ou encore l’utilisation d’orthèse moléculaire basées sur la technologie des darpins (Designed Ankyrin Repeat Proteins) (collaboration avec P. Minard, Orsay, J. Popot, IBPC, Paris, A. Polidori, Avignon). Concernant la formation du complexe, nous nous focalisons dans un premier temps sur la détermination de la stoechiométrie de la protéine MFP et sur l’ordre dans le lequel est réalisé cet assemblage. Nous abordons cette question par différentes approches telles que l’analyse par gel bleu natif (Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis : BN-PAGE) (Ferrandez, 2012) , la technique de FRAPP (collaboration W. Urback) (Reffay, 2009), ou encore la dynamique moléculaire (collaboration C. Etchebest). Ceci nous a dores et déjà permis de mettre en évidence que MexA interagit avec le trimer d’OprM par paire et que son état d’oligomérisation est pH dépendant, et est de 2 MexA pour un pH supérieur à 7,5 et de 6 MexA pour un pH inférieur à 6,5. En parallèle, afin de suivre l’ouverture d’OprM en fonction de son environnement, nous avons inséré la protéine dans une membrane artificielle supportée, afin d’effectuer des expériences d’électrophysiologie (collaboration B. Lepioufle, Cachan). Nous avons été capables de mesurer des sous-états correspondant à différents niveaux d’ouverture de la protéine (Wang, 2012). Nous allons maintenant pouvoir quantifier l’effet des mutations ponctuelles qui nous avaient été suggérées par notre étude par modes normaux, sur l’état d’ouverture de la protéine. Nous avons également commencé à développer un test pour mesurer la fonction de la pompe MexB elle-même. La protéine est inserrée dans un liposome afin de créer un compartiment clos. Comme MexB nécessite un gradient de protons pour fonctionner, la bactériorhodopsine, une pompe à proton activable par la lumière, est co-reconstituée dans le même liposome. Afin de pouvoir suivre l’effectivité du gradient de protons, de la pyranine, une molécule présentant une fluorescence pH-dépendante, est enfermée dans ces protéoliposomes. Nous avons réalisé la preuve de concept (Picard, 2012 ; Verchère, 2012). Cet outil sera de grand intérêt pour développer un test de criblage visant à mettre au point des inhibiteurs de MexB, et peut même être étendu à l’étude d’autres transporteurs. Finalement, nous avons également implémenté des tests in vivo pour caractériser les conséquences fonctionnelles de mutations ponctuelles réalisées sur nos protéines. Dans ce but, nous réalisons des expériences de complémentation dans des souches de Pseudomonas génétiquement modifiées, délétées alternativement du gène codant pour OprM ou MexB (collaboration P. Plésiat, C. Llanes, Besançon). Toutes ces approches seront menées en parallèle sur les différentes pompes de P. aeruginosa. Pour réaliser la formation complète de la pompe, nous utiliserons la technique de cryo-EM en collaboration avec O. Lambert (Trépout, 2010).

- Lomovskaya O., Zgurskaya H., Totrov M. & Watkins W. (2007) nature reviews drug discovery, 6 : 56-65

- Nakae, T. (1997). Microbiologia, 13 : 273–284.

- Nikaido H, Takatsuka Y. (2009) Biochim Biophys Acta, 1794(5):769-81

- Phan G, Benabdelhak H, Lascombe MB, Benas P, Rety S, Picard M, Ducruix A, Etchebest C, Broutin I (2010). Structural and dynamical insights into the opening mechanism of P. aeruginosa OprM channel. Structure 18 : 507–517.

- Ferrandez Y*, Monlezun L*, Phan G, Benabdelhak H, Ulryck N, Falson P, Ducruix A, Picard M, Broutin I (2012). Stoichiometry of the MexA-OprM binding, as investigated by blue native gel electrophoresis. Electrophoresis, 33(8):1282-7

- Reffay M, Gambin Y, Benabdelhak H, Phan G, Taulier N, Ducruix A, Hodges RS, Urbach W (2009). Tracking membrane protein association in model membranes. PLoS ONE 4 : e5035

- Wang W*, Monlezun L*, Picard M, Benas P, Francais O, Broutin I*, Le Pioufle B* (2012). Activity monitoring of functional OprM using a biomimetic microfluidic device. Analyst 137 : 847–852.

- Picard M, Verchere A, Broutin I (2012). Monitoring the active transport of efflux pumps after their reconstitution into proteoliposomes : caveats and keys. Anal Biochem 420 : 194–196.

- Verchere A, Broutin I, Picard M (2012). Photo-induced proton gradients for the in vitro investigation of bacterial efflux pumps. Sci Rep 2 : 306.

- Trépout S, Taveau JC, Benabdelhak H, Granier T, Ducruix A, Frangakis AS, Lambert O (2010). Structure of reconstituted bacterial membrane efflux pump by cryo-electron tomography. Biochimica Et Biophysica Acta - Biomembranes 1798 : 1953–1960.